Mit der Zunahme von Anzahl und Komplexität der Genetischen Tests steigt auch die Anzahl von unsicheren Resultaten. Eine Art von unsicheren Resultaten, welche in Laborbefunden mitgeteilt werden, sind Variants of uncertain significance (VUS). Kliniker haben die Aufgabe, die Testergebnisse richtig zu interpretieren und daraus den grösstmöglichen individuellen Nutzen für ihre Patienten zu ziehen. Nachfolgend werden VUS am Beispiel von Familiärem Brust- und Eierstockkrebs diskutiert.

Familiärer Brust- und Eierstockkrebs

Im Jahre 1994 bzw. 1995 wurden die beiden Tumor Suppressor Gene BRCA1 und BRCA2 entdeckt (1, 2). Frauen mit einer inaktivierenden Variante («pathogene Mutation») in einem dieser beiden Gene haben ein sehr hohes Risiko, im Laufe ihres Lebens an Brustkrebs und an Eierstockkrebs zu erkranken (Risiko bis zu ca. 80% bzw. bis zu ca. 50%) (3). Das Wissen um dieses hohe Risiko erlaubt betroffenen Frauen, sich für lebensverlängernde Massnahmen wie prophylaktische Operationen oder intensivierte Vorsorgeuntersuchungen zu entscheiden (4, 5).
Die kodierende Sequenz der beiden Gene BRCA1 und BRCA2 umfasst zusammen mehr als 17 000 Nukleotide. Bei einer Untersuchung dieser beiden Gene, ob nun bei einer Patientin mit Verdacht auf familiären Brust- oder Eierstockkrebs oder bei einer gesunden Person aus der Normalbevölkerung, werden in der Regel mehr als 10 Unterschiede zur «normalen» Referenzsequenz nachgewiesen. Bei den meisten dieser Unterschiede handelt es sich um benigne (gutartige) Varianten ohne irgendwelche klinischen Auswirkungen. Viele dieser benignen Varianten haben eine Häufigkeit > 1% in der Normalbevölkerung und werden auch als Polymorphismen bezeichnet. Selten hingegen sind pathogene Varianten. In der Schweiz ist geschätzt ungefähr eine von 300 Frauen (und auch einer von 300 Männern) von einer pathogenen Variante betroffen. Bei Frauen, welche im Alter von < 65 Jahren selbst an Brustkrebs erkrankt sind, würde man eine pathogene Variante mit einer Wahrscheinlichkeit von ungefähr 1 zu 30 nachweisen (6). In der Schweiz gelten aktuell engere Kriterien (z.B. bei unauffälliger Familienanamnese Brustkrebs < 40 Jahre), damit die Kosten für die Untersuchung der beiden Gene BRCA1 und BRCA2 von der Krankenkasse übernommen werden (7), so dass in der Routinediagnostik ca. bei jeder zehnten Analyse eine pathogene Mutation nachgewiesen wird. Bei einer Untersuchung der beiden Gene BRCA1 und BRCA2 wird man also für jede nachgewiesene pathogene Variante (ca. eine pro 10 Analysen) auch viele nicht pathogene Varianten nachweisen (> 10 in jeder Analyse). Es ist Aufgabe der molekulargenetischen Analyse, bei Patientinnen (und Patienten) mit Verdacht auf familiären Brust- und Eierstockkrebs möglichst alle Unterschiede zur Referenzsequenz nachzuweisen und in der Folge unter all diesen Varianten diejenigen zu finden, welche pathogen sind.

Varianten

Pathogene Varianten stören die normale Proteinfunktion. Beispiele für pathogene Varianten sind Nonsense-Varianten, Frameshift-Varianten, grosse Deletionen und Splicing-Varianten. Die pathogene Bedeutung der genannten Varianten lässt sich häufig alleine aus der Veränderung in der Nukleotid-Sequenz ableiten. So führt eine Nonsense-Mutation zur Entstehung eines verfrühten Stopp-Codons. Dies wiederum führt entweder dazu, dass die RNA abgebaut wird oder dass die Proteinsynthese vorzeitig abgebrochen wird. Mit anderen Worten: im Falle einer Nonsense-Variante kann allein an der Sequenzveränderung abgelesen werden, dass kein funktionsfähiges Protein entstehen kann. Und daraus wiederum kann geschlossen werden, dass es sich um eine pathogene Variante handelt. Bei vielen anderen Varianten hingegen, insbesondere bei Missense-Varianten, ist diese direkte Schlussfolgerung nicht möglich. Eine Missense-Variante führt zu einem Aminosäure-Austausch im entsprechenden Protein. Dies kann in seltenen Fällen tatsächlich dazu führen, dass dieses Protein seine Funktion verliert. Sehr häufig führt es aber zu keiner Beeinträchtigung der Proteinfunktion. Das Protein kann einen Aminosäureaustausch durchaus auch tolerieren. Mit anderen Worten: im Fall von Missense-Varianten kann die klinische Bedeutung nicht alleine aus der Sequenz-Information abgeleitet werden. Eine korrekte Interpretation ist nicht auf direkte Art und Weise möglich, aber für Betroffene von erheblicher Bedeutung. Eine Fehlinterpretation kann bei Patientinnen und auch bei deren Angehörigen zu grossem Schaden führen. Beispielsweise, indem sich eine Patientin für eine prophylaktische beidseitige Mastektomie aufgrund einer fälschlicherweise als pathogen interpretierten Missense-Mutation entscheidet. Oder indem sich eine andere Patientin gegen eine prophylaktische Salpingo-Oophorektomie aufgrund einer fälschlicherweise als benigne interpretierten Missense-Mutation entscheidet.

Variants of uncertain significance, VUS

Aus klinischer Sicht können in den Genen BRCA1 und BRCA2 grundsätzlich nicht nur benigne und pathogene Varianten, sondern drei Arten von Sequenzvarianten unterschieden werden (8):
1. Varianten, welche die Funktion des Proteins nicht beeinflussen und somit nicht zu einem erhöhten Krebsrisiko führen. Diese benignen Varianten werden vom Labor nicht berichtet.
2. Varianten, welche die normale Proteinfunktion stören und somit zu einem erhöhten Krebsrisiko führen. Diese Varianten («pathogene Mutationen») werden mitgeteilt und ermöglichen den Betroffenen das Ergreifen von lebensverlängernden Massnahmen.
3. Varianten, insbesondere Missense-Mutationen, welche aufgrund der aktuellen Kenntnisse weder als neutral noch als schädlich klassifiziert werden können. Die Assoziation mit einem erhöhten Krebsrisiko ist unsicher. Mit anderen Worten: die klinische Relevanz ist nicht bekannt. Diese Varianten werden als Varianten mit einer unsicheren klinischen Signifikanz (variants of uncertain significance, VUS) bezeichnet und können nicht dazu verwendet werden, Empfehlungen bezüglich prophylaktischer Ope­rationen oder intensivierten Vorsorgeuntersuchungen auszulösen. Auch eine prädiktive Testung von gesunden Familienangehörigen ist nicht angezeigt. Dennoch ist es üblich, den Patientinnen nachgewiesene VUS mitzuteilen. Begründet wird dies unter anderem damit, dass die Mitteilung von VUS Klinikern und Patientinnen potentiell erlaubt, prospektiv eine Re-Klassifizierung dieser VUS vorzunehmen. Retrospektive Studien zeigen, dass bei erfolgten Re-Klassifizierungen (aufgrund neuer Kenntnisse) bisher ein deutlich grösserer Teil der VUS neu als benigne und nur ein kleinerer Teil als pathogen re-klassifiziert worden ist (9).
Obwohl es verbreitet ist, den Patientinnen die nachgewiesenen VUS mitzuteilen, ist diese Praxis nicht unumstritten. VUS können z.B. von Klinikern und/oder Patientinnen fälschlicherweise als pathogen interpretiert werden und kostenintensive und potentiell schädliche Massnahmen auslösen (z.B. präventive Mastektomie). Oder sie können einfach auch nur verunsichern und verängstigen. So wird verschiedentlich dafür plädiert, VUS generell nicht mitzuteilen (10).

Next Generation Sequencing

Unter Next generation sequencing (NGS) versteht man eine Technologie, bei der simultan bzw. in paralleler Anordnung bis zu Millionen von Sequenzen gleichzeitig untersucht werden. Diese Hochdurchsatz-Sequenzierung ermöglicht die gleichzeitige Analyse von vielen Genen und hat dazu geführt, dass bei Verdacht auf erblichen Brust- und Eierstockkrebs zunehmend nicht nur die beiden genannten Hochrisiko-Gene BRCA1 und BRCA2, sondern häufig etliche weitere Gene sequenziert werden, welche in der Literatur mit einem erhöhten Brust- oder Eierstockkrebs-Risiko assoziiert werden. Diese Entwicklung führte insbesondere zu drei Herausforderungen (11).
1. Assoziation mit Krebs: Welche dieser weiteren Gene sind tatsächlich mit einem zusätzlichen Brust- oder Eierstockkrebsrisiko assoziiert?
2. Penetranz: Falls eine signifikante Assoziation mit Brust- oder Eierstockkrebs gezeigt werden konnte: wie hoch ist das Krebsrisiko genau?
3. Varianten-Pathogenität: Welche der vielen nachgewiesenen Varianten in diesen Genen sind «pathogen»?
Während bereits die Interpretation von Varianten in den beiden Hochrisiko-Genen BRCA1 und BRCA2 eine grosse Herausforderung darstellt, verschärft die Analyse von vielen weiteren Genen diese Problematik. Während bei ca. 3% der BRCA1/2-Analysen eine Variante als VUS klassifiziert werden muss, steigt dieser Anteil bei der Analyse von 9 Brustkrebs-Genen (BRCA1, BRCA2, PALB2, CHEK2, ATM, CDH1, NF1, PTEN, TP53) auf mehr als 12% (6). Bei 19 Brust- und Eierstockkrebsgenen steigt die Wahrscheinlichkeit auf über 20% und werden z.B. sogar 80 Gene analysiert, wird bei mehr als der Hälfte der Patientinnen eine VUS nachgewiesen (12). Die Einführung von NGS hat also zu einer Analyse von immer mehr Genen und damit zu einer Zunahme des Nachweises von Varianten und folglich auch zu einer Zunahme des Nachweises von VUS geführt. Dadurch ist der Bedarf für eine verlässliche Variantenklassifikation, welche es zudem ermöglichen sollte den Anteil von VUS möglichst gering zu halten, weitergewachsen (8).

Variantenklassifikation

Das Evidence-Based Network for the Interpretation of Germline Mutation Alleles (ENIGMA) ist ein internationales Konsortium, welches es sich unter anderem zur Aufgabe gemacht hat Varianten in Brust- und Eierstockkrebs-Genen zu klassifizieren. ENIGMA gilt in diesem Bereich als das Expertengremium schlechthin. 2019 hat ENIGMA einen Rahmen für ein einheitliches Vokabular zur Beschreibung von Varianten vorgeschlagen (13) (Tab. 1). Dieser Vorschlag beruht auf den beiden am häufigsten verwendeten Guidelines zur Klassifizierung von Sequenzvarianten, den Kriterien des American College of Medical Genetics and Genomics/Association for Molecular Pathology (ACMG/AMP) (14) einerseits und der International Agency for Research on Cancer (IARC) (15) andererseits. Der komplexe Prozess zur Variantenklassifikation gemäss diesen Guidelines beruht auf diversen Evidenz-Kriterien. Dazu gehören unter anderem Daten zur Häufigkeit von Varianten in einer Kontrollpopulation oder in der Normalbevölkerung. Und computational data (Rechendaten), welche beispielsweise auf der evolutionären Konservierung der betroffenen Aminosäure, der Lokalisierung der Aminosäure im Protein und einer physiko-chemischen Analyse des Aminosäureaustausches basieren. Und auf Ergebnissen von funktionellen Studien. Eine Auswahl von häufig verwendeten Datenbanken und in silico tools für die Klassifizierung von Varianten wird in Tabelle 2 aufgelistet.
Gemäss IARC werden Varianten als «uncertain» klassifiziert, wenn sie mit einer Wahrscheinlichkeit von 5.0% bis 94.9% pathogen sind. Gemäss ACMG/AMP haben Varianten eine «uncertain significance», wenn sie mit einer Wahrscheinlichkeit von 10.0% bis 89.9% pathogen sind.
Die Akkumulation von immer mehr genetischen Daten in den letzten Jahren führte zur Akkumulation von immer mehr VUS und zwar nicht nur in absoluten Zahlen, sondern auch prozentual (16) (Tab. 3). Trotz grossen Anstrengungen von ENIGMA (17) muss ein grosser Anteil der seltenen Missense-Varianten in den Genen BRCA1 und BRCA2 (und fast alle Missense-Varianten in weiteren Brust- und/oder Eierstockkrebs-Genen wie ATM und CHEK2) nach wie vor als VUS klassifiziert werden.
Grosse Hoffnungen für eine bessere Klassifizierung von Varianten werden in funktionelle Tests gesetzt. So konnten z.B. mittels saturation genome editing über 90% der untersuchten Missense-Varianten im BRCA1-Gen eindeutig als «funktionell» (70.6%) oder eindeutig als «nicht-funktionell» (21.1%) angesehen werden (18). Dabei zeigte sich eine hohe Übereinstimmung mit von ENIGMA bereits klassifizierten Varianten. 162 von 169 von ENIGMA-Experten als pathogen klassifizierte Missense-Varianten wurden mittels saturation genome editing ebenfalls als nicht-funktionell angesehen. Bei benignen Missense-Varianten waren es 20 von 22. Dies nährt die Hoffnung, dass mit zusätzlichen Erkenntnissen aus funktionellen Tests viele heute noch als VUS klassifizierte Varianten in der Zukunft eindeutig als benigne oder pathogen klassifiziert werden können.
Eine gemäss IARC- oder ACMG/AMP-Richtlinien korrekte Klassifizierung von Varianten ist zeitaufwändig. Eine Automatisierung des komplexen Prozesses der Variantenklassifikation und Interpretation ist denkbar. Ein erster Schritt in diese Richtung ist beispielsweise mit dem Pathogenicity of Mutation ANalyzer (PathoMAN) gelungen (19). Aufgrund der zu hohen Diskordanz mit Ergebnissen von Experten (e.g. ENIGMA) kann dieses Programm aktuell die manuelle Kurierung zwar nicht ersetzen, aber beispielsweise für eine regelmässige Re-Klassifikation von VUS eine grosse Unterstützung sein. Es bleibt abzuwarten, wie lange es dauern wird, bis Systeme mit künstlicher Intelligenz die menschliche Arbeit bei der Variantenklassifikation komplett ersetzen (20).

Genetische Beratung

Die Wahrscheinlichkeit für den Nachweis einer pathogenen Variante im BRCA1- oder BRCA2-Gen ist abhängig von der persönlichen Anamnese und der Familienanamnese. Bei einer 80-jährigen Frau ohne Krebserkrankung und ohne bekannte Familienanamnese beträgt diese Wahrscheinlichkeit nicht viel mehr als 0%. Bei einer 50-jährigen Frau mit Brust- und Eierstockkrebs, einer Schwester mit Brust- und Eierstockkrebs und einer Mutter mit Brust- und Eierstockkrebs beträgt die Wahrscheinlichkeit gegen 100%. Die Wahrscheinlichkeit für den Nachweis einer VUS beträgt hingegen immer ungefähr 3%. Das zu erwartende Verhältnis von nachgewiesenen VUS zu nachgewiesenen pathogenen Mutationen ist also abhängig von den Testkriterien. Je enger die Testkriterien festgelegt werden, desto niedriger ist dieses Verhältnis. Bei einem Bevölkerungsscreening (also ohne einschränkende Testkriterien) müsste wohl mit etwa 10 VUS pro nachgewiesene pathogene Variante gerechnet werden.
Bei einem Nachweis von pathogenen Varianten im BRCA1- und BRCA2-Gen konnte der klinische Nutzen klar gezeigt werden. Präventive Massnahmen wirken lebensverlängernd (21). Der klinische Nutzen beim Nachweis von pathogenen Mutationen in weiteren mit Brust- und Eierstockkrebs assoziierten Genen ist wesentlich unklarer, insbesondere bei Genen, welche das Brustkrebsrisiko oder das Eierstockkrebsrisiko nur moderat erhöhen. Mit jedem zusätzlich untersuchten Gen steigt aber die Anzahl nachgewiesener VUS. Im Rahmen der Genetischen Beratung müssen Patientinnen vor der Testung über die Wahrscheinlichkeit des Nachweises einer VUS und den potentiellen klinischen Nutzen informiert werden. Beides ist abhängig von den Genen, welche untersucht werden sollen. Eine gezielte Testung von wenigen Genen, welche vor dem Hintergrund von persönlicher Anamnese und Familienanamnese auch tatsächlich von klinischem Nutzen sein können, vermindert dabei das «VUS-Risiko». Wird doch eine VUS nachgewiesen, sollte dies das weitere klinische Management der Patientin nicht beeinflussen. Empfehlungen zu präventiven Massnahmen sollten in diesem Fall alleine auf Basis der persönlichen Anamnese und der Familienanamnese erfolgen.

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